Сюжет сериала вращается вокруг трех оперативников Романа Русакова (Александр Бухаров), Владимира Щукина (Анатолий Гущин) и Алексея Мухина (Илья Гавриленков). В каждой серии «Отдела» оперативники сталкиваются с новыми преступлениями. Чтобы их раскрыть, команде Русакова придется не раз отступать от правил, ведь их методы расследования эффективны, но не всегда законны. Но оперативники готовы пойти на любые жертвы, чтобы не прогибаться перед криминалом, не предавать друзей и дело, которому служат.

Сквозной линией через весь сериал проходит история о хитроумном маньяке, который одну за другой убивает девушек легкого поведения. Оперативники бьются над вопросом, почему преступник нападает только на «ночных бабочек» и лишает их жизни при помощи армейского ножа, привезенного из Непала. Разбираясь в этом деле, они пытаются вытащить из СИЗО начальника Ивана Ушанова. Ему грозит тюрьма после того, как он перешел дорогу заместителю начальника ГУВД генералу Александру Харламову (Сергей Колесников).

Но в этих драматических событиях находится место и для любви. На место Ушанова в отдел приходит подполковник Тимур Видов (Александр Никитин). Он симпатизирует Ольге Ильиной (Анастасия Заворотнюк), майору Следственного комитета. Но Ильина давно и безответно влюблена в Русакова, у которого не хватает времени на личную жизнь.